Nature重磅 | 横空出世，一类新的编辑器诞生，David Liu首次对线粒体DNA进行编辑

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细菌毒素代表了巨大的生化多样性储备，可以重新用于生物医学应用。此类蛋白质的成员已发现在基因编辑技术中的应用。由于先前描述的胞苷脱氨基酶在单链核酸上作用，因此它们在碱基编辑中的使用要求解开双链DNA（dsDNA），例如通过CRISPR–Cas9系统。迄今为止，线粒体DNA（mtDNA）中的碱基编辑受到与引导RNA进入线粒体相关的挑战的阻碍。

2020年7月8日，博德研究所David R. Liu及华盛顿大学医学院Joseph D. Mougous共同通讯在Nature 在线发表题为“A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing”的研究论文，该研究描述了一种细菌间毒素，将其命名为DddA，它可以催化dsDNA中胞苷的脱氨。

该研究设计了无毒且无活性的split-DddA半分子：DddA分割的一部分结构域（转录激活子样效应子阵列蛋白）和尿嘧啶糖基化酶抑制剂的融合，产生了无RNA的DddA衍生的胞嘧啶碱基编辑器（DdCBE），可催化人mtDNA中的C•G到T•A转化，具有高靶标特异性和产品纯度。该研究使用DdCBEs建模人类细胞中与疾病相关的mtDNA突变，从而导致呼吸速率和氧化磷酸化的改变。不含CRISPR的DdCBE可以精确操纵mtDNA，而不是消除因被靶向核酸酶切割而产生的mtDNA拷贝，这对线粒体疾病的研究和潜在治疗具有广泛的意义。

另外，2020年6月29日，博德研究所David Liu在Nature Biotechnology 在线发表题为“Programmable m6A modification of cellular RNAs with a Cas13-directed methyltransferase”的研究论文，该研究证明了具有截短的METTL3甲基转移酶结构域或者是METTL3：METTL14甲基转移酶复合物与核定位dCas13融合体，可以对细胞质RNA进行特异性m6A掺入，而前者的融合蛋白脱靶活性特别低。跨多个位点的独立细胞测定法证实，这种靶向RNA甲基化（TRM）系统以高特异性介导了有效的m6A安装在内源RNA转录物中。最后，该研究表明TRM可以诱导m6A介导的转录本丰度变化和选择性剪接。这些发现将TRM确立为用于靶向转录组工程的工具，可以揭示单个m6A修饰的作用并分析其功能作用（点击阅读）。

2020年6月22日，博德研究所David Liu团队在Nature Biotechnology 在线发表题为“Genome editing with CRISPR–Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors”的综述文章，该综述首先描述已表征的Cas9和Cas12核酸酶的天然变异体，并详细介绍具有扩大的靶向范围和特异性的Cas9和Cas12核酸酶变异体的开发。接下来，该综述讨论碱基编辑器的开发和应用，这些编辑器可精确安装点突变而无需双链DNA断裂（DSB）或供体DNA模板。最后，该综述总结了新兴的CRISPR–Cas基因组编辑工具，包括介导大片段DNA重排的Cas转座子和重组酶，以及主要编辑器，它们以取代原始DNA序列的方式直接将编辑后的序列复制到目标DNA位点（点击阅读）。

2020年6月12日，博德研究所David R. Liu团队在Cell 在线发表题为“Determinants of Base Editing Outcomes from Target Library Analysis and Machine Learning”的研究论文，该研究在哺乳动物细胞中38,538个基因组整合靶标上表征了11个胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑器（CBE和ABE）的序列-活性关系，并使用所得结果训练了BE-Hive，这是一种机器学习模型，可准确预测碱基编辑基因型结果（R ≈0.9）和效率（R≈0.7）。研究人员以≥90％的准确度纠正了3388个与疾病相关的SNV，其中包括675个等位基因，其“旁观者”核苷酸被BE-Hive正确预测，因此无法编辑。该研究发现了以前无法预测的C-to-G或C-to-A编辑的决定因素，并利用这些发现以≥90％的准确性纠正了174个病原性SNV的编码序列。最后，该研究利用BE-Hive的见识来设计新颖的CBE变体，以调节编辑结果。这些发现启发了碱基编辑，实现了以前难以处理的目标的编辑，并为新的基础编辑器提供了改进的编辑功能。

mtDNA的遗传或获得性突变与一系列人类疾病有关。迫切需要用于对mtDNA进行特定修饰的工具，以对这些疾病进行建模和潜在治疗。然而，这类工具的开发受到了将RNA转运到线粒体（包括对与CRISPR相关的蛋白质进行编程所需的引导RNA）的挑战的阻碍。

每个哺乳动物细胞都含有许多环状mtDNA拷贝，这些拷贝可以存在于野生型和突变等位基因的混合物中。当前操作mtDNA的方法依赖于无RNA的可编程核酸酶，例如TALENs和锌指核酸酶，与线粒体靶向信号（MTS）序列融合以诱导mtDNA中的双链断裂。线性化的mtDNA迅速降解，导致异质性转移，有利于未切割的mtDNA基因组。作为一种候选的治疗或疾病建模工具，这种方法不能在mtDNA中引入特定的核苷酸变化，并且由于破坏所有mtDNA拷贝被认为是有害的，因此无法应用于同质mtDNA突变。

文章设计原理（图源自Nature ）

通过双链断裂有针对性地破坏mtDNA的另一种方法是精确的基因组编辑，到现在为止，但是未在mtDNA报道过。精确安装或校正致病性突变的能力可以加快由mtDNA突变引起的疾病的建模，促进临床前候选药物测试，并有可能实现直接校正致病性mtDNA突变的治疗方法。尽管胞苷和腺苷脱氨酶通过在核中进行碱基编辑对精确的基因组编辑很重要，但它们的生化和功能多样性仍未得到充分开发。细菌基因组包含各种未表征的脱氨酶，这增加了某些细菌可能具有独特的活性以启用新的基因组编辑功能的可能性。

该研究描述了一种细菌间毒素，将其命名为DddA，它可以催化dsDNA中胞苷的脱氨。该研究设计了无毒且无活性的split-DddA半分子。DddA分割的一部分结构域（转录激活子样效应子阵列蛋白）和尿嘧啶糖基化酶抑制剂的融合，产生了无RNA的DddA衍生的胞嘧啶碱基编辑器（DdCBE），可催化人mtDNA中的C•G到T•A转化，具有高靶标特异性和产品纯度。该研究使用DdCBEs建模人类细胞中与疾病相关的mtDNA突变，从而导致呼吸速率和氧化磷酸化的改变。不含CRISPR的DdCBE可以精确操纵mtDNA，而不是消除因被靶向核酸酶切割而产生的mtDNA拷贝，这对线粒体疾病的研究和潜在治疗具有广泛的意义。

参考消息：

https://www.nature.com/articles/s41586-020-2477-4

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